La galerie François Ier avait pour fonction de relier les appartements du roi, installés dans le donjon de saint Louis, à la chapelle de la Trinité. Au-dessus de la galerie se trouvait la bibliothèque, riche d’environ 2700 volumes. Les "F" et les salamandres rappellent que cette galerie fut édifiée sous François Ier qui en confia la décoration au peintre italien Giovanni Battista di Jacopo, dit Rosso Fiorentino. Le Rosso s’inspire du chef-d’œuvre de son maître Michel Ange, la chapelle Sixtine.
Le décor de la galerie constitue une innovation majeure dans l’histoire de l’art : pour la première fois un décor est composé de fresques associées au stuc en haut relief, au-dessus d’un lambris de bois sculpté. Ce système décoratif est décliné des deux côtés de la galerie sur sept travées. Le type d’ornements utilisé est popularisé dès sa création par des estampes et diffusé dans toute l’Europe. Sous François Ier, la lumière pénétrait par les deux longs côtés, mais au XVIIIe siècle, le bâtiment fut doublé côté nord pour créer de nouveaux appartements. Les anciennes fenêtres furent donc occultées.