Charles Quint reste, pendant tout le règne, l’ennemi majeur de François Ier. Faute d’avoir été retenu par les électeurs impériaux, François Ier fera tout pendant dix ans pour empêcher Charles Quint de descendre en Italie pour se faire sacrer par le pape. Tant que ce rituel n’est pas accompli, Charles ne peut faire élire un successeur sous le nom de « roi des Romains », ce qui laisse ouverte l’élection impériale s’il venait à mourir.
La bataille de Pavie, en 1525, marque un tournant décisif dans le combat entre les deux souverains. Elle vaut au roi de France plus d’un an de captivité en Espagne et permet à l’empereur de se rendre à Bologne et d’être le dernier empereur romain couronné par le pape, en 1530, le jour anniversaire de Pavie.
François Ier se voit dans l’obligation de signer le traité de Madrid dont il ne respectera pas les termes : le roi avait en effet promis à l’empereur de restituer la Bourgogne dans les six mois. Arguant qu’on ne peut s’engager sous la contrainte, il se contentera d’une rançon, laissant ses fils en otage pour en garantir le paiement.
C’est le traité de Cambrai en 1529 qui met temporairement fin aux hostilités entre François Ier et Charles Quint. Le roi de France renonce à ses prétentions italiennes et récupère la Bourgogne, mais il cède l’Artois et les Flandres. Signé par Louise de Savoie (mère de François Ier), Marguerite d’Autriche (tante de l’empereur Charles Quint) et Marie de Luxembourg, ce traité est connu sous le nom de « paix des Dames » ; Pour sceller cette entente, François Ier, veuf depuis plusieurs années, accepte d’épouser Éléonore de Habsbourg, la sœur de l’empereur. Enfin, le traité négocie, en échange d’une énorme rançon, la libération des enfants royaux, François et Henri (futur Henri II). Sur cette tapisserie, offerte à Charles Quint en 1531 par les états généraux de Bruxelles, le roi de France, dont la monture vient de s’écrouler, est relevé par des soldats de l’armée impériale.